化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)？說到靶向蛋白質(zhì)組學(xué),咱們都知道,一直以來蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域主要是針對基礎(chǔ)生物學(xué),比如研究通路、蛋白復(fù)合物、互作網(wǎng)絡(luò),表征細(xì)胞和組織的類型,觀察細(xì)胞周期內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)等。近年來,由于技術(shù)的飛速發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)開始被用于醫(yī)學(xué)研究和藥物研究。比如說藥物研究,國內(nèi)可能用得還不多,但在歐美已經(jīng)開始越來越廣泛。那么，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)？一起來了解一下吧。
這個概念最早是在1995年提出的，它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識。
目前，在蛋白質(zhì)功能方面的研究是極其缺乏的。大部分通過基因組測序而新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能都是未知的，而對那些已知功能的蛋白而言，它們的功能也大多是通過同源基因功能類推等方法推測出來的。有人預(yù)測，人類基因組編碼的蛋白至少有一半是功能未知的。因此，在未來的幾年內(nèi)，隨著至少30種生物的基因組測序工作的完成，人們研究的重點(diǎn)必將轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)功能方面，而蛋白質(zhì)組的研究正可以完成這樣的目標(biāo)。在蛋白質(zhì)組的具體應(yīng)用方面，蛋白質(zhì)在疾病中的重要作用使得蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。
疾病的產(chǎn)生可能僅僅是因?yàn)榛蚪M中一個堿基對的變化，如β-血紅蛋白第六位上的Glu變?yōu)閂al就導(dǎo)致了鐮刀型細(xì)胞貧血癥的發(fā)生。然而，對于大多數(shù)疾病來說，其疾病發(fā)生機(jī)制要復(fù)雜的多。因此，對于疾病發(fā)生的分子機(jī)制的認(rèn)識就需要一些能夠解決這些復(fù)雜性的方法來完成。而作為細(xì)胞中的活性大分子，蛋白質(zhì)無疑是與疾病相關(guān)的主要分子，蛋白表達(dá)水平的改變是與疾病，藥物作用或毒素作用直接相關(guān)的。
說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院助理研究員庫鑫博士所授。
大伙兒都知道，蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics），是研究一種細(xì)胞或者一種生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。雖說現(xiàn)在基因組測序火得一塌糊涂，但是，我們不要忽略了，蛋白質(zhì)才是執(zhí)行生命體功能的基本單元，而且蛋白質(zhì)都是通過形成各種復(fù)合物，組成通路網(wǎng)絡(luò)，去行使各種生物學(xué)功能的！所以，有很多生物學(xué)問題只能在蛋白質(zhì)層面上去研究去探索，而且需要站在系統(tǒng)的層面去考察，比如說：蛋白-蛋白相互作用、蛋白的細(xì)胞定位、翻譯后修飾、信號通路及代謝通路的調(diào)控和功能等。這就是為啥蛋白質(zhì)組學(xué)如此重要啦！
既然重要，科學(xué)家們自然是想盡辦法來研究了！最開始使用的技術(shù)就是傳說中的雙向凝膠電泳（2-DE），由于分辨率低、蛋白質(zhì)重疊等各種問題，無論是通量還是準(zhǔn)確度，都不盡如人意。當(dāng)質(zhì)譜技術(shù)興起以后，就迅速被替代了。
說起質(zhì)譜技術(shù)的誕生，估計很多小伙伴都聽過那個著名的diao絲逆襲的段子，講的就是2002年諾貝爾化學(xué)獎得主田中耕一，作為蛋白質(zhì)譜發(fā)明人之一，由于一個不小心在實(shí)驗(yàn)時錯加了甘油，結(jié)果神奇地將質(zhì)譜技術(shù)引入到鑒定生物大分子的應(yīng)用領(lǐng)域。
1.蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。
2.翻譯后修飾：很多mRNA表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式，因此對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。
3.蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析/配基-受體結(jié)合分析。可以利用基因敲除和反義技術(shù)分析基因表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。另外對蛋白質(zhì)表達(dá)出來后在細(xì)胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的一個很好的工具。
4.對人類而言，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康，主要指促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和疾病機(jī)理研究中，了解人不同發(fā)育、生長期和不同生理、病理?xiàng)l件下及不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)的特點(diǎn)具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子，進(jìn)一步為設(shè)計作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。
雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)
雙向凝膠電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的研究蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。雙向凝膠電泳技術(shù)利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量差別將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜聯(lián)用的特點(diǎn)，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質(zhì)組研究手段。雙向凝膠電泳技術(shù)及質(zhì)譜基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究程序?yàn)闃悠分苽洹入娋劢埂郾０纺z電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)→膠內(nèi)酶切→質(zhì)譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用數(shù)據(jù)庫確定蛋白。蛋白質(zhì)組研究要求有高分辨率的蛋白質(zhì)分離及準(zhǔn)確、靈敏的質(zhì)譜鑒定技術(shù)。凝膠電泳中蛋白質(zhì)的著色不僅影響蛋白質(zhì)分離的分辨率，同時也影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。蛋白質(zhì)的染色可分為有機(jī)試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術(shù)上的改進(jìn)，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ谕粔K膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念。兩種樣品中的蛋白質(zhì)采用不同的熒光標(biāo)記后混合，進(jìn)行2-DE，用來檢測蛋白質(zhì)在兩種樣品中表達(dá)情況，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。
說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。
第一步：剪碎去血
將樣品放入PBS緩沖溶液中剪碎，倒掉變色的溶液，換入新的PBS，繼續(xù)剪，一遍一遍地重復(fù)，直到PBS溶液不變色為止。比如肝臟組織，洗完后整個是一個偏黃色的組織。在這個過程中，我們需要用剪刀和鑷子剝離血管組織和脂肪組織等，這些組織的存在會對我們對樣品，比如肝臟組織的蛋白質(zhì)類型產(chǎn)生干擾。去血的過程中同時需要加入蛋白酶抑制劑。
第二步：稱重
為了稱量更精確，洗滌之后可以用濾紙將樣品吸干，然后再稱重，能比較準(zhǔn)確地知道我們大約使用了多少組織樣品。
第三步：碎裂
碎裂樣品的方法在上一篇推文里有詳細(xì)的介紹，包括液氮研磨、勻漿等機(jī)械破碎，溫差法、壓力法等物理破碎，以及加入變性劑等化學(xué)處理法。通常情況下呢，用液氮研磨就夠了，研磨到完全變成粉狀。但如果用單一的方法破碎效果不好，或者操作起來工作量太大，也可以進(jìn)行多方法的組合。比如十幾個或幾十個樣品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的運(yùn)動量估計也差不多了，累成狗！這時候可以考慮使用組織破碎儀，一次可以做八個十個的，一起震碎，那就輕松多了。
以上就是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的全部內(nèi)容，對于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究來說,它的最基本的實(shí)驗(yàn)手段就是利用雙向凝膠電泳(two-dimensional protein electrophoresis, 2DE),在整個 基因組水平上檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的情況。雙向凝膠電泳首先利用等電點(diǎn)聚焦來分離不同等電點(diǎn)的蛋白,再利用SDS-PAGE來分離不同分子量的蛋白,其分辨率是非常高的。
