目錄illumina高通量測序原理 菌群高通量測序 土壤微生物高通量測序 高通量單細(xì)胞測序技術(shù) 微生物測序是什么意思
病原微生物宏基因組高通量測序呈陽團(tuán)侍性意味著實(shí)驗(yàn)中檢測到的樣本中包含有病原微生物的遺塵侍傳物質(zhì)，也就是說這個(gè)樣塌兄吵本是由這些病原微生物引起的。宏基因組高通量測序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測出樣品中存在的所有微生物，從而幫助我們準(zhǔn)確診斷感染性疾病。
在陸地生態(tài)中，在土壤中生活有數(shù)量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌及超顯微結(jié)構(gòu)微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍(lán)藻除外) 、地衣等。它們與植物和動(dòng)物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，擔(dān)負(fù)著地球C、N、P、S 等物質(zhì)循環(huán)的“調(diào)節(jié)器”[1 ]、土壤養(yǎng)分植物有效性的“轉(zhuǎn)化器”和污染環(huán)境的“凈化器”等多方面生態(tài)功能[2 ]。土壤微生物是氣候和土壤環(huán)境條件變化的敏感指標(biāo)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態(tài)特征多樣性和功能多樣性[3 ]。由于土壤微生物的復(fù)雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動(dòng)、植物相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。隨著多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序等現(xiàn)代生物學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術(shù)的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數(shù)據(jù)，為直接探究土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進(jìn)行研究的方法
1、微生物平板培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的土壤生態(tài)中微生物群祥賀猜落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現(xiàn)型來分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。
這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養(yǎng)的微生物類群，無法對絕大多數(shù)微生物的分類拍戚地位和發(fā)育關(guān)系的深入研究。
2、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合測序的方法
在過去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其16SrDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定未知菌的研究中。20世紀(jì)80年代以來, 逐步建立起了以分子發(fā)育分析為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩(wěn)定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。
其中運(yùn)用比較廣泛并被普遍認(rèn)可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴(kuò)增所需G/C 堿基對含量至少達(dá)40 % ，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個(gè)群落細(xì)菌數(shù)量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因?yàn)榻咏?0 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現(xiàn)序列不同的DNA 遷移在同一位置的現(xiàn)象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600堿基的序列，足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進(jìn)行初步的估計(jì)[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)大量用于微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應(yīng)的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決于發(fā)育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優(yōu)越性體現(xiàn)在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區(qū)域； 測序通量高，可以檢測到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實(shí)驗(yàn)操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)；無需進(jìn)行復(fù)雜的文庫構(gòu)建，微生物DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測序，實(shí)驗(yàn)謹(jǐn)型周期短；測序數(shù)據(jù)便于進(jìn)行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認(rèn)可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。高通量測序因其數(shù)據(jù)量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應(yīng)出土壤樣本的真實(shí)情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應(yīng)用
1、 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細(xì)菌、真菌和放線菌這三大類群的數(shù)量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態(tài)中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數(shù)量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進(jìn)行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454測序法對西半球的一個(gè)大的橫斷面的4類土壤進(jìn)行檢測和統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)。結(jié)果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農(nóng)業(yè)土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結(jié)果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點(diǎn)所有序列的0.009%，而農(nóng)業(yè)土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細(xì)菌的多樣性差距非常大，因土壤結(jié)構(gòu)的不同土壤中的細(xì)菌群體也呈現(xiàn)出多樣化。Triplett等[10]基于焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區(qū)域進(jìn)行測序，估測9個(gè)草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數(shù)據(jù)序列進(jìn)行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發(fā)現(xiàn)在不同的土壤層中，細(xì)菌發(fā)生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質(zhì)有關(guān)的，包括有機(jī)碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養(yǎng)元素在土壤中轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能等, 通過分析測定土壤中的一些轉(zhuǎn)化過程, 如有機(jī)碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應(yīng)是硝化作用的第一步，也是全球氮循環(huán)中由微生物活動(dòng)形成硝化鹽的重要進(jìn)程。Leininger[11]檢測了3個(gè)氣候區(qū)域12塊原始和農(nóng)業(yè)用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個(gè)亞基的基因豐度。采用反向轉(zhuǎn)錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術(shù)對互補(bǔ)DNA測序，證實(shí)古細(xì)菌的氨氧化活性要遠(yuǎn)高于細(xì)菌，證實(shí)Crenarchaeota可能是土壤生態(tài)中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法同時(shí)獲得土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和功能信息。結(jié)果認(rèn)為，通過該方法可以同時(shí)研究微生物生種群結(jié)構(gòu)與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學(xué)分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達(dá)特征之間的關(guān)系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時(shí)也需要運(yùn)用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結(jié)構(gòu)對應(yīng)起來。對rRNA表達(dá)基因和與環(huán)境因素相關(guān)的主要酶類的基因進(jìn)行定量化和比較分析，將能了解微生物結(jié)構(gòu)與特定功能之間的關(guān)系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環(huán)過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結(jié)合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個(gè)土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離并鑒定了9個(gè)參與反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究環(huán)境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環(huán)境的突然改變會(huì)導(dǎo)致微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。Zachary等[14]以重水穩(wěn)定同位素探測技術(shù)（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關(guān)的細(xì)菌。通過液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結(jié)合到了所有的DNA結(jié)構(gòu)成分中。盡管這種結(jié)合不是均勻的，還是可以明顯的將標(biāo)記了18O和未標(biāo)記的DNA區(qū)分開來。作者發(fā)現(xiàn)DNA和細(xì)胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發(fā)生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩(wěn)定的，并且摻入到細(xì)菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕后，對土壤中16S rRNA進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動(dòng)態(tài)變化，對微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)行研究和生態(tài)類群的劃分。
如芹悉高何讀懂微生物測序數(shù)據(jù)質(zhì)量宏基因組是指特定環(huán)境中全部生物（微生物）遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組測序是利用高通量測序技術(shù)對環(huán)境陸遲樣品中全部微生物的基因組進(jìn)行測定，以獲得單個(gè)樣品的飽和數(shù)據(jù)量，可進(jìn)行微生物群體的基因組成及功能注釋，微生物群體的物種分類，多樣性分析，群落結(jié)構(gòu)分析，樣品間的物種或基因差異以及物種間的代謝網(wǎng)絡(luò)研究，探索微生物與環(huán)境及宿主之間的關(guān)系，發(fā)掘和研究新的具有特定功能的基因等。與傳統(tǒng)方法相比，基于高通量測序的宏基因組研究無需構(gòu)建克隆文庫，這避免了文庫構(gòu)建過程中利用宿主菌對樣品進(jìn)嫌尺行克隆而引起的偏差，簡化了實(shí)驗(yàn)操作，提高了測序效率。此外，宏基因組測序研究擺脫了微生物分離純培養(yǎng)的限制，擴(kuò)展了微生物資源的利用空間，為環(huán)境微生物群落的研究提供了有效。通過宏基因組深度測序可以揭示或估計(jì)環(huán)境中真實(shí)的物種多樣性和遺傳多樣性，挖掘具有應(yīng)用價(jià)值的基因資源，應(yīng)用于開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)，為研究和開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)提供有力支持。
高通量測序不需要把三個(gè)平行都放在一起分析。根據(jù)相關(guān)信息顯示個(gè)PCR混合常用于高通量測序過程中，用于睜茄消除單次PCR帶來的誤差。近年來DNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性有了很大的提高，是否需要做那么多平行(時(shí)間、金錢、人力成本)開始受到人們的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)實(shí)施于3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室，測試不同扮早滑環(huán)境（糞便、土壤、海洋沉積物、海水、皮膚、口腔、床墊灰塵樣本）得到的373個(gè)樣本，比較單廳臘次PCR和3次PCR混合產(chǎn)物經(jīng)16S測序后的差異。結(jié)果表明單次PCR得到的reads顯著高于三次PCR混合，且A.單次PCR的sequencingdropoutrate更低。B.alpha多樣性(shannon)無顯著差異，C.UnweightedUniFrac表征的beta多樣性表明樣本按照不同環(huán)境，而不是PCR平行數(shù)分開。D.WeightedUniFrac表明樣本之間的差異不同環(huán)境>生物學(xué)重復(fù)>技術(shù)重復(fù)。
在人體腸道中生活著數(shù)以萬億的共生菌群，它們的種類繁多，可達(dá)上千種，數(shù)量也很驚人，是人體細(xì)胞總量的10倍以上，迄今為止，仍有80%以上的微生物不為人知。這些腸道微生物和人體存在著互利共生的關(guān)系，對于維持人類的健康發(fā)揮著重要的作用。它們在腸道中保持著一種動(dòng)態(tài)的平衡，能夠合成維生素、幫助人體從食物中吸收營養(yǎng)、維持腸道免疫功能、抵擋有害微生物的侵害，但是當(dāng)這種平衡因某些因素被打破致使腸道菌群發(fā)生紊亂時(shí)，人體就可能患上諸如肥胖癥、糖尿病、腸炎甚至癌癥等疾病。為了加深對人類疾病發(fā)生原因、藥物作用機(jī)理的理解，繼人類基衫如埋因組計(jì)劃之后，科學(xué)家們又啟動(dòng)了人類元基因組計(jì)劃，這使腸道菌群的研究迎來了一個(gè)新的浪潮。
在以往的腸道微生物群落多樣性研究中，人們主要采用DGGE等分子生物學(xué)方法及生物芯片對腸道菌群進(jìn)行研究，但是這些或螞方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能檢測到環(huán)境樣品中十幾種優(yōu)勢菌，但是對痕量微生物卻束手無策；電泳條帶中包含不只一種16S rDNA序列，要獲橡猜悉具體的菌種信息，還需進(jìn)行克隆、測序，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣；此外，采用這種方法不能反映微生物的豐度情況。而生物芯片通過固定在芯片上的探針來獲得微生物多樣性的信息，“只能驗(yàn)證已知，卻無法探索未知”，通過信號強(qiáng)弱判斷微生物的豐度也不是非常的準(zhǔn)確。新一代高通量測序技術(shù)自2005年問世以來，以其數(shù)字化信號、高數(shù)據(jù)通量、高測序深度、高準(zhǔn)確率等特點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用于腸道菌群的研究中，發(fā)表的論文達(dá)60多篇，其中不乏發(fā)表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等國際頂尖雜志上的文章。Roche 454測序由于讀長較長，達(dá)300～500bp，能跨越16S rDNA序列一個(gè)或幾個(gè)可變區(qū)，是微生物多樣性研究的最佳，使用該發(fā)表的關(guān)于腸道菌群的論文達(dá)50多篇。美吉生物擁有Roche 454測序，在腸道微生物群落多樣性研究方面積累了大量的成功案例。
美吉生物研究人員通過大量相關(guān)文獻(xiàn)的閱讀，發(fā)現(xiàn)高通量測序技術(shù)在腸道菌群多樣性研究中的應(yīng)用主要聚焦于以下幾個(gè)方面：① 飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關(guān)系；② 腸道菌群與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)；③ 抗生素治療對腸道菌群的影響；④ 不同個(gè)體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及其受其他外界因素（壓力、致病菌感染、手術(shù)）的影響等。
